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海外科研新进展近日美国密西西比州立大学海岸研究和推广中心的Park教授发表了文章《Development of Multienzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA) Combined with Lateral-Flow Dipstick (LFD) Assay to Detect Species-Specific tlh and Pathogenic trh and tdh Genes of Vibrio parahaemolyticus》,收录在SCI期刊《Pathogens》。实验中建立了一种MIRA-LFD检测副溶血性弧菌快速、简单的方法。在资源有限的田间条件下,不仅能快速检测副溶血性弧菌的tlh基因,还能快速检测该基因的两个致病性trh和tdh基因。 副溶血性弧菌 副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性的嗜盐细菌,生活在世界范围内温暖的河口和海洋环境中。它是重要的食源性致病菌之一,通常发生在人们在食用受污染的生的、未煮熟的海鲜后。美国疾病控制和预防中心估计,在美国约有84,000人因弧菌感染而遭受食源性疾病。 副溶血性弧菌的trh基因编码的耐热相关溶血素和tdh基因编码的耐热直接溶血素,已被认为是副溶血性弧菌诱导的胃肠炎致病性的关键指标。并且tlh基因编码耐热性溶血素大多数毒力分离株显示trh和/或tdh阳性。 实验方法 实验中分别将正向、反向引物和探针加入到MIRA试剂,在40◦C下孵育15 min进行扩增反应。再用羧基荧光素(FAM)和抗原标记(生物素)标记,将MIRA产物用杂交检测缓冲液稀释。将LFD的样品垫浸泡在稀释后的溶液中,室温下孵育2 min,观察条带显色。同时采用qPCR、PCR方法做了实验对比,验证MIRA-LFD灵敏度。 (MIRA-LFD检测tlh、tdh和trh基因工作流程) 灵敏度: (分别使用MIRA-LFD、qPCR、PCR检测gDNA样本和细菌培养样本) 实验使用了4个10倍连续稀释的样本,从1 pg到1 fg分别做了检测;细菌培养样本从2×103 CFU到2 CFU。 MIRA-LFD对tlh、tdh和trh基因的检测结果分别为10 fg、细菌培养2 CFU。 特异性: 利用副溶血性弧菌和其他食源性致病菌的基因组DNA评估MIRA-LFD的特异性,MIRA-LFD检测结果显示,阳性对照副溶血性弧菌F11-3A的tlh、trh和tdh基因的检测品系呈阳性,其他则显示阴性。 MIRA-LFD对靶基因具有高度特异性,但与其他密切相关的细菌没有交叉反应。 (MIRA-LFD检测副溶血性弧菌及其他弧菌和食源性致病菌) 实验结论 通过MIRA-LFD检测准确扩增基因的靶区,并在20 min内提供检测结果。可检测到低至10 pg的gDNA和2 CFU的副溶血性弧菌,具有较高的特异性
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