海外科研新进展

近日美国密西西比州立大学海岸研究和推广中心的Park教授发表了文章《Development of Multienzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA) Combined with Lateral-Flow Dipstick (LFD) Assay to Detect Species-Specific tlh and Pathogenic trh and tdh Genes of Vibrio parahaemolyticus》，收录在SCI期刊《Pathogens》。实验中建立了一种MIRA-LFD检测副溶血性弧菌快速、简单的方法。在资源有限的田间条件下，不仅能快速检测副溶血性弧菌的tlh基因，还能快速检测该基因的两个致病性trh和tdh基因。

副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性的嗜盐细菌，生活在世界范围内温暖的河口和海洋环境中。它是重要的食源性致病菌之一，通常发生在人们在食用受污染的生的、未煮熟的海鲜后。美国疾病控制和预防中心估计，在美国约有84,000人因弧菌感染而遭受食源性疾病。

副溶血性弧菌的trh基因编码的耐热相关溶血素和tdh基因编码的耐热直接溶血素，已被认为是副溶血性弧菌诱导的胃肠炎致病性的关键指标。并且tlh基因编码耐热性溶血素大多数毒力分离株显示trh和/或tdh阳性。

实验方法

实验中分别将正向、反向引物和探针加入到MIRA试剂，在40◦C下孵育15 min进行扩增反应。再用羧基荧光素（FAM）和抗原标记（生物素）标记，将MIRA产物用杂交检测缓冲液稀释。将LFD的样品垫浸泡在稀释后的溶液中，室温下孵育2 min，观察条带显色。同时采用qPCR、PCR方法做了实验对比，验证MIRA-LFD灵敏度。

（MIRA-LFD检测tlh、tdh和trh基因工作流程）

灵敏度：

（分别使用MIRA-LFD、qPCR、PCR检测gDNA样本和细菌培养样本）

实验使用了4个10倍连续稀释的样本，从1 pg到1 fg分别做了检测；细菌培养样本从2×10³ CFU到2 CFU。

MIRA-LFD对tlh、tdh和trh基因的检测结果分别为10 fg、细菌培养2 CFU。

特异性：

利用副溶血性弧菌和其他食源性致病菌的基因组DNA评估MIRA-LFD的特异性，MIRA-LFD检测结果显示，阳性对照副溶血性弧菌F11-3A的tlh、trh和tdh基因的检测品系呈阳性，其他则显示阴性。

MIRA-LFD对靶基因具有高度特异性，但与其他密切相关的细菌没有交叉反应。

（MIRA-LFD检测副溶血性弧菌及其他弧菌和食源性致病菌）

实验结论

通过MIRA-LFD检测准确扩增基因的靶区，并在20 min内提供检测结果。可检测到低至10 pg的gDNA和2 CFU的副溶血性弧菌，具有较高的特异性

安普未来生物不断发展，已和国内知名高校科研老师进行深入合作，现在逐渐被国外科研老师知晓，海外科研成果将间见层出，期待安普未来生物在国际舞台上发挥作用。