直播回顾|恒温扩增结合CRISPR技术应用

近年来，基于CRISPR的核酸检测方法，因其较高的特异性和灵敏度，也已被应用于感染类诊断方法的开发。CRISPR诊断方法crRNA准确识别核酸靶标序列，并激活CRISPR蛋白剪切报告分子，从而释放出信号实现靶标的检测。然而，由于缺乏合适技术的引入和集成，现有大多数CRISPR诊断平台仍只能检测少数核酸靶标分子，那么结合恒温扩增技术又会碰撞出怎样的火花？

MIRA与Cas12a检测体系原理：

目的基因经过恒温扩增富集，Cas12-crRNA复合体识别目的基因，激活Cas蛋白的切割活性，从而切割报告探针，释放荧光型号，结果读取可以为荧光曲线、蓝光灯下肉眼观察；胶体金探针被切割，就可以通过试纸条显色方式结果判定。

MIRA结合Cas13a检测原理：

通过恒温扩增来富集目的基因产物，与Cas12前端扩增区别点在于，Cas13a前端的恒温扩增产物有T7启动子序列，经过T7转录酶转录为单链RNA，此单链RNA被Cas13-crRNA复合体识别，Cas13的切割活性被激活，切割报告探针。结果呈现和Cas12一样有荧光型、肉眼判读、胶体金型等。

不管是Cas12或Cas13的检测都离不开前端核酸的扩增，因此前端的MIRA基础型核酸扩增至关重要，同时前端核酸扩增的灵敏度决定后端Cas蛋白检测的灵敏度。

MIRA+cas12a的体系配制

MIRA扩增体系，包括：缓冲buffer、上下游引物、模板、启动buffer、水补充到50ul体系

Cas12a切割体系包括：缓冲Buffer、Cas12a蛋白、恒温扩增产物、crRNA等

注意：MIRA恒温扩增产物是不需要任何处理直接加入到cas蛋白切割体系的。

MIRA+cas13a体系配制

MIRA基础扩增体系，包括：缓冲buffer、上下游引物、模板、启动buffer、水补充到50ul体系

Cas13a体系，包括：cas13a蛋白、恒温扩增产物、crRNA、报告探针、RNA酶抑制剂、转录所需缓冲buffer、T7转录酶、A/C/G/U转录所需辅料等，

再次强调：同样，MIRA扩增产物也不需要任何处理可直接加入到Cas13a切割体系的。

两种切割体系对比：

    cas12a需要有TTTV的PAM区，cas13a不需要；

    cas12a蛋白被双链DNA激活切割活性，Cas13a被单链RNA激活切割活性；

    cas12a切割单链DNA，因此报告探针设计为单链DNA；

  同样cas13a切割单链RNA，报告探针设计为单链RNA；

前端MIRA扩增，引物设计区别在于Cas13a需要在上引物加上T7启动子序列；最终的试纸条检测所用试纸条均为CRISPR专用试纸条，而非普通核酸检测试纸条。

MIRA结合CRISPR检测应用场景多样化，由于不受温度条件、设备限制及环境条件的约束，可应用到社区医院、社区监测站、海关检疫、家用自测等多方面。

武汉大学殷浩老师课题组发表的，建立了MIRA结合cas12一管法检测平台。本文章为提高一管法灵敏度及检测时间使用次优PAM区做了一系列的验证。

推测一：在一管法反应中，CRISPR检测即Cas蛋白切割与恒温扩增可能存在竞争关系，标准PAM与cas蛋白结合力强，使这种竞争关系偏向于cas蛋白切割，导致恒温扩增底物缺乏而延迟或停止扩增，最终导致信号延迟、灵敏度下降。

 为验证以上推测，作者对次优PAM进行探究；首先标准PAM的第一个核苷酸如果换成其他会是什么样的结果呢？

 作者以新冠Orf基因为例，对第一个核苷酸变更的次优PAM进行了两步法、一步法数据验证，发现两步法时标准PAM优于次优PAM，一步法时次优PAM检测优于标准PAM。说明标准PAM第一个核苷酸变更对一管法是有检测意义的。

对标准PAM的第二个核苷酸也进行了变更验证，将T变更为A/G/C，结果发现第二个碱基为C时一管法反应效果更好。

对标准PAM第3/4个核苷酸变更也做了一系列验证，发现也是有一定规律，具体结果可以看殷浩老师的文章。

以上验证均以新冠的ORF基因、E基因、N基因为检测基因得出的数据，仅为RNA型核酸检测是否能说明这一规律呢？

作者进行了DNA型核酸检测此处选用HPV18，对这一规律进行验证，发现是适用的,具体结果见文章详情。

经过大量的测试最终得出结论，80%以上的次优PAM会在一管法反应中荧光信号强度增强、检测时间缩短。得出最优次优PAM为VTTV,第二次优为TCTV。

接下来作者进行了一些灵敏度的测试，发现与标准PAM相比，次优PAM灵敏度也能提高10-100倍。

作者用实际样本人巨细胞病毒也做了灵敏度测试，同时与QPCR进行灵敏度对比，灵敏度优于Qpcr10倍。

荧光曲线检测灵敏度高是否同样肉眼可观察呢，作者进行了应用拓展，发现反应15-20分钟肉眼判读灵敏度为24cp/反应，与Qpcr的灵敏度是一致的。

同时也做了胶体金试纸条检测，灵敏度与荧光相比，略差。

作者前端做的所有的实验都是用MIRA试剂盒进行的，他们也考虑到此方法是否适用其他的恒温扩增试剂盒呢，就做了安普未来试剂盒与TwistDx试剂盒对比:

  前端基础扩增灵敏度测试几乎无差异，但安普未来试剂盒电泳数据条带更清晰明亮；

  又进行了恒温扩增+Cas12a一管法检测，结果我们的试剂盒在灵敏度和荧光检测强度方面均优于TwistDx试剂盒。

  最终得出结论：MIRA试剂与Cas12a缓冲环境兼容性更好。

建立的sPAMC检测方法与其他检测方法进行了对比，优势在于；一管法的反应，不需要其他条件限制灵敏度较高，达1cp/ul，反应时间较短15-20min。

  整个文章讲下来作者是做了大量的实验验证，并且做的结果也比较好，总结下来有以下几点：1、灵敏度高、检测时间短，实际项目测试了人巨细胞病毒、新冠病毒，灵敏度与QPCR相当、检测时间在10-15min。

  作者也着重验证了我们试剂与cas蛋白的兼容性更好。

  第二篇文章是《MIRA结合cas13a双重胶体金试纸条检测》，希望能给我们后续的研究带来一些启发。

实验流程：核酸提取 → MIRA基础扩增富集底物 → T7转录酶将双链DNA转录成单链RNA，cas13a-crRNA复合体识别并激活切割活性 → 切割报告探针（荧光检测/试纸条检测）

检测体系的优化，除了之前一直强调的MIRA前端恒温扩增引物筛选之外，CRISPR体系也有一些优化，首先需要筛选crRNA，从结果可以看到不同crRNA序列对检测也会有一定影响。此处选择新冠N基因，N-8作为最优crRNA。

CRISPR荧光检测方法条件优化

  • 探针选择：probe1

  • MgCl 2的终浓度：20uM

  • T7 RNA聚合酶：1.5U/uL

  • RNase抑制剂：0.8U/uL

  • 牛磺酸：10uM

  • MIRA引物浓度：5uM

作者双重胶体金试纸条的检测原理是我们比较关注的地方，同时也可能会跟我们提供一些新的思路：

    T线检测N基因，C2线作为检测内参的质控线，

  这里N基因由MIRA扩增后被cas13a识别并切割，T线检测，灵敏度高；

  内参基因由MIRA扩增，扩增产物携带地高辛、TAMRA，由C2线检测；

  引入内参的意义在于，保证样本有效性，防止假阴。

双重试纸条结果显示，灵敏度在0.25cp/UL，且无交叉反应，特异性较好。

  同时也做了荧光型检测，灵敏度也在0.25cp/UL，且无交叉反应，特异性较好。

  最终文章研究意义在于：灵敏度较高、可以做早筛判定、确保样本的有效性，同时此免疫层析的方法，不需要配合仪器使用，降低成本，在简单的环境下就能进行。

安普未来生物团队历经十多年的技术沉淀，开发出代表未来生物检测技术趋势的多酶恒温快速扩增技术MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification）。并以MIRA为核心平台技术研发出“超快速核酸释放技术”、“双通道恒温荧光检测仪”、“一体化全自动封闭检测系统”、“自测型核酸检测装置”等一系列配套产品，并计划启动“微流控芯片技术”“小型自动化检测系统”等多方面的新型产品，力求打造出快速分子检测领域的整体解决方案，将MIRA技术的灵敏度高、特异性强、快速简便、污染风险小、现场作业等特点充分体现出来。