文章分享丨MIRA-CRISPR/Cas12a一管法，实现ASFV核酸免提取快速检测

文章标题：A suboptimal PAM-driven one-tube CRISPR/Cas12a assay for extraction-free and ultra-rapid detection of African swine fever virus

发表单位：山西农业大学兽医学院等

发表期刊：Sensors and Actuators: B. Chemical

影响因子：7.7

MIRA 技术本身具备等温、快速、简便等特点，在现场操作拥有显著优势。研究团队通过优化，将MIRA技术与CRISPR-Cas12a平台完美整合，解决了传统两步法检测中易开盖污染和扩增产物损失的问题，同时通过次优PAM调控Cas12a活性，实现One-Pot扩增与检测同步。

该平台可实现免提取、现场快速操作，检测单管兼容，灵敏度可达1copy/μL，特异性良好，为快速、精准、现场可操作的ASFV检测提供核心技术支撑。

实验方法设计

样本（血液、血浆或拭子）经快速核酸释放处理后，MIRA在单管中快速扩增靶核酸，为Cas12a提供足量底物，动力学匹配Cas12a切割反应，增强信号放大。

侧流试纸由样本垫、共轭垫（AuNPs+anti-FAM）、C线（链霉亲和素）和T线（山羊抗鼠二抗）组成，未切割探针在C线形成红条，Cas12a激活后切割探针，FAM片段迁移至T线形成红条，实现结果判读。整个流程可在约20分钟内完成，灵敏度高（1copy/μL）、特异性强且无需仪器操作，适合现场快速检测。

MIRA技术在其中核心作用是快速累积扩增产物、保证Cas12a检测信号充分释放，支撑平台的高效灵敏检测性能。

（用于核酸可视化检测的试纸条示意图）

寡核苷酸的设计与优化

实验中通过比较不同引物对及不同crRNA在MIRA等温扩增体系下的信号输出情况，筛选最优组合，为现场快速检测提供可靠的扩增和信号基础。

• 快速等温扩增：MIRA提供高效多酶恒温扩增，使得在37℃条件下迅速形成足量扩增产物，为Cas12a检测提供充分模板。

• 信号放大与兼容性：MIRA与Cas12a协同工作，保证扩增产物与CRISPR检测体系匹配，避免过早切割导致信号损失。

• 增强灵敏度与特异性：通过MIRA的快速扩增能力，该实验能够明显区分不同引物/crRNA组合，帮助筛选最佳检测组合，从而提升整体检测灵敏度和特异性。

（MIRA引物和crRNA的筛选）

不同PAM序列介导的crRNAs特性研究

• Panel A–B（两管体系）：TTTV PAM显示快速且高强度荧光信号，TVTV PAM信号明显减弱，说明在两管体系中PAM活性过强会影响扩增与切割的协调。

• Panel C–D（sCRAM One-Pot平台）：采用次优PAM（TVTV）在sCRAM平台中产生更高的荧光信号上升速度和最终强度，显示sCRAM平台通过MIRA的快速扩增与Cas12a检测相匹配，充分释放扩增产物信号，显著提升灵敏度。对照组（NC）在所有条件下均未产生明显信号，证明检测特异性良好。

sCRAM平台结合MIRA等温快速扩增和次优PAM Cas12a检测，可在单管体系中实现快速、灵敏、特异的ASFV核酸检测，相较传统两管体系显著提升了检测效率和信号释放效果，是One-Pot现场快速检测的核心技术支撑。

（不同PAM序列介导的crRNAs的特性）

SCRAM检测ASFV的特异性

sCRAM平台结合MIRA等温快速扩增和Cas12a检测能够在多种常见猪病毒背景下实现高度特异的ASFV核酸检测，UV和LFS均可直观读取结果，为现场快速、灵敏且特异的ASFV检测提供核心技术支撑。

（SCRAM法检测ASFV的特异性评价）

样本验证

实验中收集111份实际样本，其中20份ASFV阳性样本，91份阴性样本（包含健康猪样本及其他常见猪病毒样本，例如PRRSV、PPV、JEV、PCV、PRV等）分别使用sCRAM One-Pot 平台的UV检测与LFS检测与qPCR试剂盒对比，显示了极高的灵敏度与特异性。

sCRAM平台依托MIRA等温快速扩增与Cas12a检测，实现 单管、快速、灵敏、特异的ASFV核酸检测，在UV光和试纸两种读取方式下均表现出高诊断性能，为现场快速病毒检测提供核心技术支撑。

（ASFV检测的临床表现分析)

课题组梳理比较了多种分子诊断方法在ASFV核酸检测中的性能，从以下三个方面进行对比。

• 样本处理的简便性：大多数方法依赖DNA提取试剂盒，而sCRAM平台实现免提取处理，简化操作流程。

• 检测限：传统qPCR灵敏度为1.28 copies/μL（质粒），RPA/RAA为 100 copies/μL，LAMP为10–30 copies/μL，CRISPR组合方法为 5.7×10^4–10 copies/μL；而sCRAM平台的 LOD 达到1 copy/μL，表现出最高灵敏度。

• 检测时间：传统qPCR和ddPCR需62–110分钟，RPA/RAA、LAMP及 CRISPR组合方法 25–60 分钟；sCRAM平台仅需 20 分钟即可完成检测。

总体优势：sCRAM 在灵敏度、快速性和免提取操作上均优于其他方法，特别适合现场快速检测，兼顾高灵敏度、操作简便和低设备依赖。

创新优势

• 基于MIRA等温快速扩增技术构建了sCRAM One-Pot CRISPR-Cas12a 平台，实现了非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸的免提取、单管、快速、灵敏、特异检测。

• MIRA技术提供多酶等温扩增，快速累积ASFV核酸扩增产物，作为 Cas12a底物直接触发切割反应，显著提升检测灵敏度（LOD 可达1 copy/μL）。结合次优PAM设计，使扩增与切割同步进行，避免过早切割导致信号损失，实现信号放大与快速判读无缝衔接。

• MIRA技术与LbaCas12a以及LFS或UV检测方式高度兼容，使检测结果可直观读取，同时支持单管操作，极大简化操作流程并降低交叉污染风险。

整体而言，MIRA技术不仅是sCRAM平台实现高灵敏、快速和现场可操作检测的核心驱动力，也为未来病毒快速筛查与多样本高通量检测提供了技术基础和可推广方案。

安普未来MIRA技术

MIRA多酶恒温快速核酸扩增是真正实现现场快检的技术。