MIRA结合试纸条快速检测致病菌

溶血葡萄球菌是一种革兰氏阳性凝固酶阴性细菌，在医院中非常常见。近年来由于医院获得性感染的风险较高，受到越来越多的关注。溶血葡萄球菌可进一步导致皮肤感染、脑膜炎、腹膜炎，甚至败血症。临床诊断的延迟会导致健康状况的恶化，因此快速诊断溶血葡萄球菌是精确治疗的关键。

中国连云港市第二人民医院中央实验室科的季拓老师课题组，在《Analytica Chimica Acta》期刊上发表文章《A rapid and visual detection of Staphylococcus haemolyticus in clinical specimens with MIRA-LFS》，影响因子6.2。

1.研究概述

在该研究中，建立了一种基于mvaA基因的MIRA-LFS检测溶血葡萄球菌的方法，使用多酶恒温快速核酸扩增技术MIRA与侧流试纸条LFS结合，实现快速病原体检测。

实验在37℃下进行，可在9min内检测到结果，检测灵敏度为0.147CFU/反应。

MIRA-LFS检测方法适用于临床样本中溶血葡萄球菌的定点检测，实现了POCT鉴别溶血葡萄球菌的方法，对医疗服务不足地区的快速疾病诊断和治疗具有重要价值。

课题组用MIRA-LFS、qPCR和传统细菌培养方法对95个随机临床样本进行分析，证实了临床适用性。

2.研究方法

MIRA-LFS检测示意图如上所示。

研究使用了安普未来生物的DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）、核酸检测试纸条。

mvaA基因引物长度为30-35个核苷酸，扩增产物长度为100-350bp，共设计6对候选引物。利用标准溶血葡萄球菌菌株的gDNA进行MIRA分析，筛选候选引物，用2%琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物。

（使用琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物）

再根据正向引物序列（向后延伸16bp）设计探针。探针的5’端用FITC标记，3’端标记C3阻断。利用THF替换探针中31位的核苷酸，THF距离5’端30bp，距离3’端15bp。所选的反向引物的5’端用生物素进行标记。

（引物探针组合的交叉二聚体和序列修饰示意图）

并且，课题组优化了溶血葡萄球菌MIRA-LFS检测的反应条件。在37℃下，从4-12min每间隔2min进行测试。结果显示在8min反应时间，试验线清晰可见。另外，从22-52℃，每间隔5℃进行测试。37-42℃是最适合MIRA-LFS检测的温度。因此，溶血葡萄球菌MIRA-LFS法的最佳反应时间和温度，分别为8min和37℃。加上最终结果在1min内通过LFS可视化，总检测时间为9min。

（反应时间、温度的优化）

3.实验结果

1. 灵敏度验证

从连续稀释的溶血葡萄球菌培养物（10^6-10^0CFU/mL）中获得的不同浓度的基因组DNA（gDNA）进行MIRA-LFS检测。

（不同浓度下的阳性信号）

通过概率单位回归分析显示，MIRA-LFS检测法测定的95% LOD为0.147CFU/反应。

（检测限计算）

2. 特异性验证

通过分析18株常见的致病微生物菌株和15株临床溶血葡萄球菌菌株，测定了溶血葡萄球菌MIRA-LFS检测的选择性。结果显示，MIRA-LFS检测对其他18种致病菌均为阴性，对15个已验证的溶血葡萄球菌临床样本均呈阳性。

（分别检测8株标准致病菌菌株、15株临床溶血性链球菌菌株）

MIRA-LFS检测具有高选择性，适合溶血葡萄球菌的筛选。

3.实际样本检测

连云港第二人民医院随机采集的95份标本，包含皮肤软组织35份、尿液16份、痰14份和血液30份样本。

（不同方法检测95例临床标本）

结果表明，该检测方法与qPCR法符合度达100%。此外，与金标准（GB/T4789.11-2003）相比，MIRA-LFS检测方法鉴定溶血葡萄球菌感染的灵敏度和特异性分别为100%和98.73%。这些结果进一步验证了该方法在检测临床样本中溶血葡萄球菌的技术可行性。

MIRA-LFS方法用于快速POCT检测溶血葡萄球菌，具备高效、准确、简单、经济成本低的特性，有助于快速做出诊断和治疗决策。

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