分子诊断技术在呼吸道感染诊断中的应用

一、呼吸道传染病及呼吸道病毒概述

呼吸道传染病是指病原体从人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸道感染侵入而引起的有传染性的疾病。

呼吸道病毒是指以呼吸道为侵入门户，在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的病毒。

呼吸道病毒的传播方式容易引发大流行导致传染疾病的暴发，如甲型流感病毒曾引起世界性的大流行，2003年的SARS，是迄今为止尚未有效控制的世界性呼吸道传染病。儿童及免疫力低下的人群是呼吸道病毒感染的高危人群，临床表现“感冒样”症状、常继发细菌感染，引起病情加重。常见的呼吸道病毒包括：A型流感病毒（甲型流感病毒）、B型流感病毒（乙型流感病毒）、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1、2和3型，这类呼吸道病毒的致病性和发病率各不相同。各种病毒在电镜下的形态如图所示:

二、主要的呼吸道病毒及其所致呼吸道

感染性疾病

呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒均是引起呼吸道感染的常见病原体，也是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要原因。

三、呼吸道病毒感染的特点

a.病原学复杂，病毒变异性大、高度传染性，易在人群中造成爆发流行。

b.大部分情况下，病毒入侵部位、入侵后繁殖部位、由此引起发的组织和免疫病理改变以及表现出的临床症状和体征的部位基本在呼吸道；

c.一般情况下，大多数病毒不通过血液侵入机体其他部位，往往查不出病毒血症；

d.有些病毒还可以引起肠道病毒感染；

e.表面感染后获得的免疫力，一般来说是不持久的；

f.临床上出现症状时，病毒滴度已经达到高峰，故抗病毒预防比抗病治疗更重要。

四、主要呼吸道病毒介绍

◆呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）属副黏液病毒科肺炎病毒属，有包膜，基因组为单股负链RNA，是引起1岁以下婴幼儿下呼吸道感染（包括毛细支气管炎和肺炎）最常见的病原体，年龄较大的儿童和成人感染症状相对缓和，通常表现为上呼吸道感染或支气管炎。临床症状主要表现为高热、咽干、鼻塞等，婴幼儿还可表现为喘息、呼吸频率增快甚至呼吸衰竭。

◆ 腺病毒（Adenovirus，ADV）属于腺病毒科，是一种没有包膜的双股DNA病毒颗粒，呈二十面体立体对称结构。人类腺病毒分为A~G共7个组，56个血清型；其中3、7、11、21、14型等主要引起婴幼儿肺炎和上呼吸道感染；其中3型和7型腺病毒为腺病毒肺炎的主要病原。此外，3、7、1 4型可引起咽结膜热，8、9、31型可引起流行性角膜炎，40、41型可引起儿童病毒性胃肠炎。腺病毒感染可造成多种疾病，如：普通感冒、急性扁桃体炎、中耳炎、毛细支气管炎、肺炎、结膜炎、腹泻、肝炎、心肌炎、病毒性肌炎等。感染后症状通常为高热、咽痛、流鼻涕、咳嗽、耳痛、“红眼”、腹泻等。腺病毒肺炎是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发于6个月至5岁儿童。

◆ 副流感病毒（Parainfluenza virus，PIV）是一类有包膜的单股负链RNA病毒，分为I型~IV型，其中I~III型是引起儿童（尤其是婴幼儿）急性呼吸道感染的常见病原体。临床症状表现为发热、鼻塞、喉咙痛、喘息甚至呼吸道梗阻。PIV1/PIV2是与哮吼（咽炎、喉炎、声门和气管表面炎症，造成声门狭窄）相关最突出的致病因子，6个月～3岁为好发年龄。PIV3引起1岁以内婴幼儿毛细支气管炎和肺炎，发病率仅次于RSV占第二。PIV4引起轻型上呼吸道感染，不引起严重疾病。PIV感染后以IFN和局部抗体为主要保护因子，免疫力不持久。

五、发热呼吸道症候群病原哨点监测的必要性

◇病毒感染的早期诊断和对症治疗

◇明确病因——指导治疗决策

◇减少抗菌素的不合理使用；

◇发现末知病原——导致临床疾病

◇监控新发或突发传染病，快速、准确的实验室检测是早期发现传染病病例和传染病早期预警的有效科学手段;

◇探索新的预防方法。

六、呼吸道病毒的检测方法

每种方法各有优势，依据病毒确定实验室检测策略——病毒诊断的发展方向

a.检测抗体/抗原——ELISA/HI/PA、蛋白印迹、免疫荧光

b.检测病毒——中和实验、基因芯片、病毒分离、ELISA、电镜、免疫荧光

c.检测——RT-PCR、实时荧光定量PCR—多病原检测、LAMP、基因芯片、MIRA技术等

6.1详述呼吸道病毒检测方法

6.1.1 病毒抗原检测

呼吸道标本病毒抗原的快速检测是病毒感染早期诊断的主要方法之一。方法简便，设备要求低，适合临床实践中病毒感染的早期快速诊断，但标本来源与质量、取材时机均可影响检测结果，且阴性无指导意义。

6.1.2 病毒抗体检测

机体感染病毒后首先出现IGM，随后IGG抗体升高，因而IGM水平的升高对病毒感染的早期诊断有一定的价值。只有急性期和恢复期双份血清IGG比较有4倍以上的升高才有诊断意义，但双份血清临床采集困难，可行性差。免疫功能低下/应用糖皮质激素等免疫抑制剂者及婴儿病毒感染时常不能产生或延迟产生抗体而导致假阴性。

6.1.3 病毒培养分离

通过标本对病毒进行培养分离是诊断病毒感染的金标准；其能证实被检标本中存在活的、能在体外成功复制的病毒，可以分离大部分常见的呼吸道病毒。经典病毒分离培养方法有动物培养、鸡胚培养和组织细胞培养。但此方法检验周期约3-21天，培养条件要求高，易失败，不利于疾病早期诊断。

6.1.4 病毒核酸扩增

呼吸道标本中提取病毒核酸，利用病毒基因特异的寡核苷酸作为引物，加入热稳定的核酸聚合酶，在合适温度下对病毒的特异基因片段进行重复扩增，采用多种不同的方法检测病毒特异性的扩增产物。具有很高的敏感性，特异性强，有早期诊断价值。多重PCR可同时检测多种病毒，提高了检测效率。

◇公共卫生实验室检测技术的发展趋势——多病原、自动化、高通量、现场技术

◇注意：任何一种检测方法均需结合临床综合考虑，检测方法之间互相补充和印证。呼吸道病毒种类众多，且临床症状相似，多重PCR技术的检测效率高、特异性强、灵敏度好的优点是此类病毒确诊的首选手段。对于抗原检测结果为阴性的患儿建议使用核酸检测进行确诊。